通用名稱(chēng)
非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒（熒光探針?lè)?，免提取?/p>
主要成分
作用與用途
本試劑盒用于定性檢測(cè)非洲豬瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV）特異性核酸片段，為臨床監(jiān)測(cè)和診斷非洲豬瘟病毒感染豬提供檢測(cè)數(shù)據(jù)。非洲豬瘟確診應(yīng)根據(jù)臨床癥狀，流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。
檢測(cè)原理
本試劑盒以PCR方法結(jié)合熒光探針，核酸提取與純化同步操作，直接通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的累積過(guò)程中熒光信號(hào)的變化對(duì)非洲豬瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)的特異性核酸片段進(jìn)行檢測(cè)。
用法
1. 適用樣本類(lèi)型本試劑盒適用于豬口鼻眼拭子、組織和血液或血清等樣本中非洲豬瘟病毒的核酸檢測(cè)。
2. 樣本采集
2.1 口鼻眼拭子樣本的采集：采集患病豬口鼻眼拭子樣本，用專(zhuān)用采樣棉簽，適度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物，眼分泌物要用拭子在眼瞼下充分擦拭，迅速將棉簽放入裝有400μL樣本稀釋液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。拭子采樣以溶解到樣本稀釋液中可以看到組織懸浮物為最佳。
2.2 組織樣本的采集：無(wú)菌采集病豬組織樣本約0.1g，置于1.5mL無(wú)菌離心管中。
2.3 全血樣本的采集：抽取豬靜脈血1mL，置于含有適量抗凝劑的采血管中（抗凝劑建議采用EDTA或檸檬酸三鈉，不應(yīng)采用肝素）；
2.4 血清樣本的采集：抽取豬靜脈血1mL,注入無(wú)菌收集管中，室溫不超過(guò)4小時(shí)（約30-60分鐘），待樣本自行析出血清，或直接1600rpm離心5分鐘分離出血清，轉(zhuǎn)移至新的滅菌離心管中備用。
3. 保存
采集的待測(cè)樣本可立即用于檢測(cè)，待測(cè)樣本在2～8℃保存不應(yīng)超過(guò)三天；-20±5℃保存不超過(guò)一個(gè)月；-70℃以下可以長(zhǎng)期保存。應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作程序
1. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備
從試劑盒中取出ASFV-PCR反應(yīng)液、ASFV-陰性對(duì)照品和ASFV-陽(yáng)性對(duì)照品，待所有組分完全溶解后，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心5秒。
2. 樣本處理
2.1 口鼻眼拭子樣本處理：無(wú)需樣本處理，即可直接上樣。
2.2 組織樣本處理：取約黃豆粒大小組織樣本（約0.1g）置于無(wú)菌1.5mL離心管中，加入200μL樣本稀釋液，使用手持式組織研磨儀充分研磨至勻漿。另取出一個(gè)新的無(wú)菌1.5mL離心管，加入30μL組織樣本裂解液，再加入30μL組織勻漿液，渦旋混勻，置于95℃加熱5min后，12000rpm離心2min，吸取上清液5μL上樣。
2.3 血液樣本處理：
全血樣本處理：經(jīng)樣本稀釋液稀釋10倍后，即可直接上樣；
血清樣本處理：經(jīng)樣本稀釋液稀釋5倍后，即可直接上樣。
3. 加樣
按下表體系，在0.2mLPCR管中配制反應(yīng)液。試劑用畢后將剩余試劑立即放入-20±5℃保存。
3.1 在一個(gè)分裝有反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中加入5μL的ASFV-陰性對(duì)照品；
3.2 將步驟2.樣本處理中取得的待檢樣本充分震蕩混勻，然后按照5μL/樣本分別加入分裝有反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中；
3.3 在最后一個(gè)分裝有反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中加入5μL的ASFV-陽(yáng)性對(duì)照品；
以上操作建議在冰浴條件下進(jìn)行，操作完畢壓緊管蓋，瞬時(shí)離心。
注：使用卡尤迪生物科技Mini8全系列熒光定量PCR儀時(shí)，建議使用無(wú)色透明的0.2mLPCR管，切勿使用有顏色，磨砂的PCR管，因?yàn)樵搩x器熒光讀取方式為側(cè)面激發(fā)和收集熒光信號(hào)。
4. PCR擴(kuò)增
將反應(yīng)管放置到PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄加樣順序。
4.1 按下表設(shè)置反應(yīng)條件
4.2 熒光通道的選擇
請(qǐng)選擇FAM通道檢測(cè)ASFV的核酸。
判定
1. 試驗(yàn)成立條件：
1.1 陰性對(duì)照品FAM檢測(cè)通道無(wú)S型擴(kuò)增曲線(xiàn)；
1.2 陽(yáng)性對(duì)照品FAM檢測(cè)通道有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值≤23；
1.3 陰、陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)符合上述結(jié)果，則實(shí)驗(yàn)有效。
2. 結(jié)果判定
2.1 如果樣本在FAM 通道有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值≤23，則判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性；
2.2 如果FAM通道有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)且 Ct值在23-30之間，則需要復(fù)檢。復(fù)檢結(jié)果如果樣本FAM 通道仍有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)且Ct值≤30，則判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性，否則為陰性。
注意事項(xiàng)
1. 開(kāi)始檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)，按要求操作。
2. 各區(qū)物品均為專(zhuān)用，不得交叉使用，避免污染；實(shí)驗(yàn)后立即清潔工作臺(tái)。
3. 擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員。
4. 本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供科研使用，對(duì)病豬的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征，病史，其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。
5. 檢測(cè)為陰性，并不代表為非感染狀態(tài)，具體診斷結(jié)果須結(jié)合其他臨床診斷結(jié)果判斷。造成檢測(cè)為陰性的可能是：①不合理樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理、樣本中病毒濃度過(guò)低，②未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾因素如：服用抗病毒藥物等。
6. 樣本中DNA濃度低于本產(chǎn)品的最低檢出限時(shí)可能出現(xiàn)假陰性。
7. 核酸反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各熒光定量PCR反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。
儲(chǔ)存與有效期
本試劑盒中樣本裂解液和樣本稀釋液應(yīng)儲(chǔ)存于 2～8℃；其余組份應(yīng)儲(chǔ)存于-20±5℃的避光條件，有效期為12個(gè)月，盡量避免反復(fù)凍融。
批準(zhǔn)文號(hào)
獸藥生字031418939
